Dewan di Istana Holy Rood. Dia mengatakan bandar ini mempunyai rusuhan. Seseorang yang tidak dikenali baginya di hadapan orang ramai - mumers, bertopeng, penari dengan loceng, orang dengan tudung hitam - mengancam, meramalkan dan mendesak orang untuk tidak mematuhi ratu. Pengadilan Ratu Riccio mengesahkan bahawa dia juga memerhatikan dari semasa ke semasa ketika orang-orang dengan senang hati mendengar khotbah ini. Halaman ini lebih jauh memberitahu bahawa orang-orang masuk ke kapel ratu sambil berteriak: "Sarang para paus!", Bahawa Darnley, suami ratu, melompat ke mezbah dan mulai berpura-pura menjadi khutbah, dan orang-orang menjawabnya dengan kopet mengejek. Ratu Mary Stuart dalam keadaan putus asa. Dia merasakan kebencian orang-orang, kebanyakan pengadilan telah meninggalkannya; dia tertanya-tanya bagaimana agama Kristiannya dapat sangat berbeza dengan agama Kristian orang-orang Scotland. Riccio mengusulkan untuk segera membuat keputusan yang menghukum mereka yang bertanggungjawab atas rusuhan tersebut. Maria menentukan halamannya, halaman tersebut menjelaskan sama ada akan memasukkan nama Heinrich Darnley, suami kepada permaisuri. Mary teragak-agak; dia mengesyaki bahawa rusuhan itu diilhami olehnya - bagaimanapun, orang ramai dipimpin oleh raja. Di sini Riccio mengingatkannya bahawa dia adalah permaisuri; dia seperti matahari, dan dia berhak menghukum dari Tuhan. Dia menuntut segera memanggil pegawai bertugas untuk mengumumkan keputusan Ratu. Douglas masuk. Maria menyuruhnya membawa surat itu kepada Canselor Diraja Morton, supaya dia mencopnya. Douglas mengimbas keputusan tersebut dan melihat bahawa ia tidak mempunyai nama raja. Dia bertanya kepada permaisuri mengenai perkara ini. Riccio bertanggungjawab untuknya. Douglas semakin marah. Dia mendesak permaisuri untuk tidak menggunakan tindakan penindasan berdarah, mengisyaratkan dia melihat ini sebagai pengaruh Perancis atau Itali. Tetapi ratu dengan dingin mengingatkannya akan kekuatannya untuk menghilangkan perkara yang tidak taat kepada kehendaknya. Pertengkaran meletus antara Riccio dan Douglas, Douglas mencabar Riccio untuk berduel dan bersumpah bahawa dia akan membunuh orang Venesia esok. Permaisuri itu pergi dan membawa Riccio pergi. Douglas ditinggalkan sendirian, dia sedang mempertimbangkan pertarungan. Morton masuk. Douglas menunjukkan kepadanya keputusan itu. Morton tidak tegas: dia takut akan kemarahan raja dan permaisuri. Tanpa cap, Morton menawar raja. Pada masa ini, Henry terlibat dalam perbualan dengan jesternya Nick, yang menggodanya dengan fakta bahawa ratu itu mempunyai kekuatan yang sebenarnya di Scotland, dan Henry hanya suaminya, bahawa ratu memilih orang yang dekat, misalnya, harpis Itali ini Riccio ... Pada masa ini, Morton membawa keputusan yang tidak bernasib baik. Raja dalam keadaan marah, dia memutuskan untuk membunuh Riccio. Raja Lindsay memasuki istana, dia memanggil raja untuk berburu dengan elang yang baru diperoleh. Morton menjawab bahawa raja sudah mempunyai pekerjaan sekarang. Lindsay dengan rela hati bergabung dengan rancangan menentang Riccio. Dia benar-benar melarang membunuh Riccio malam ini, kerana dia mesti membunuhnya esok pagi. Kemudian Henry, memanfaatkan kelewatan itu, menghantar jester itu kepada ahli nujum untuk mengetahui lokasi bintang-bintang itu untuk tujuannya.
Ahli nujum di makmalnya (dia juga seorang ahli alkimia) berpendapat dengan dirinya sendiri bahawa pengalaman mengesahkan kesia-siaan sains, tujuan itu, kehendak bintang menguasai manusia, membuang kebaikan dan kejahatan. Nick masuk, taburkan dengan sihir, ahli nujum tidak kalah dengan dia dengan akal. Nick melaporkan bahawa raja menghantarnya untuk bertanya mengenai nasib Riccio dan memberitahu ahli nujum untuk meramalkan kematian Riccio. Ahli nujum menjawab bahawa bintang-bintang akan memberitahunya, bukan orang, dan pada gilirannya meramalkan kematian jester. Dengan itu dia pergi. Halaman ratu yang disebabkan oleh ahli nujum muncul. Page sangat menyukai perempuan simpanannya. Ahli nujum memberitahunya untuk memberitahu permaisuri bahawa hari ini lelaki yang dia cintai akan mati. "Bagaimana, Botwell akan mati hari ini?" - seru halaman. Ahli nujum hairan. Dia ingat Riccio dan bergegas halaman untuk memberi amaran kepadanya tentang perkara ini. Tinggal sendirian, ahli nujum itu bertanya-tanya - ia juga muncul dari bintang-bintang yang Botwell entah bagaimana berhubungan dengan gelap dengan ratu - melalui Mars, Saturnus ... Botwell masuk. Dari monolognya, menjadi jelas bahawa dia tiba-tiba mendapati dirinya berada di rumah seorang ahli nujum. Menyedari di mana dia sampai, Botwell bertanya kepada ahli nujum berapa banyak yang tinggal untuk tinggal. Orang tua itu menjawab bahawa tiga tahun dan Botwell akan menjadi raja. Botwell mengeluarkan sebotol racun yang dengannya dia ingin membunuh diri, ingin membuangnya - dan ragu-ragu. Sesungguhnya, dalam suasana intrik-intrik istana, senjata apa pun akan berguna. Dia pergi.
Halaman memberitahu ratu bahawa Riccio akan datang tidak lama lagi. Ratu menantikannya - menurut pendapatnya, dia sendiri tetap setia padanya. "Dan Botvel?" Halaman bertanya. "Siapa Botvel?" - permaisuri berminat. Halaman yang terkejut memberitahu Maria bagaimana, ketika berperahu, angin kencang memetik bunga mawar dari kepala permaisuri, bunga jatuh ke dalam air. Dan kemudian salah seorang istana - Botvel - bergegas ke kapal dan dengan kejam mengejar pendayung untuk menangkap bunga mawar dari air. Setelah mendengar cerita, Mary menghantar halaman untuk berdoa. Dia mengaku kepada Tuhan bahawa dia tidak lagi memiliki kekuatan untuk menolak cintanya kepada Botwell. Ratu tahu bahawa di mahkamah dia dianggap cinta dengan Riccio. Riccio masuk. Mary melaporkan bahaya maut yang mengancamnya dan dengan dingin mengucapkan selamat tinggal kepadanya, menunjuknya ke kapal yang akan membawanya ke Rom. Dalam putus asa, Riccio cuba meminta permaisuri untuk membatalkan keputusan untuk pergi. Ratu bersikeras.
Heinrich, Morton, dan Lindsay mengetahui tentang keberangkatan Riccio yang akan datang dan dengan tergesa-gesa berunding untuk membunuhnya atau membiarkannya berlayar. Kemudian Douglas muncul dan melaporkan bahawa Riccio sudah berlayar. Douglas dalam keputusasaan, dia merindui balas dendam berdarah, kehormatan ksatria dia terluka. Tiba-tiba mereka menemui halaman yang membawa permaisuri nota dari Riccio - dia tidak pergi dan akan bersamanya pada waktu petang. Para konspirator mengambil nota itu.
Maria sibuk menyulam di biliknya. Riccio, yang datang, menjelaskan kepadanya bahawa dia tidak boleh pergi, kerana dia bertengkar dengan Douglas pada waktu pagi. Dia mengakui bahawa dia tidak memerlukan hidup tanpa cintanya. Dia meminta Mary memberinya karangan bunga mawar - dia akan menanam bunga di mezbah di Rom ... Henry, Douglas dan Dindsay masuk dan membunuh Riccio. Ratu pengsan. Douglas dilanda rasa malu dan ngeri - dia secara sukarela bersara ke pengasingan. Henry bimbang jika permaisuri akan membencinya. Lindsay membawa raja pergi, berbisik kepadanya tentang perburuan yang akan datang. Ratu Botwell dijemput oleh Ratu. Mary sedar, melihat Botvel dan mengaku cintanya kepadanya. Botvel memaksanya untuk mengakui bahawa dia menginginkan kematian Henry dan memberinya sebotol racun, dengan mengatakan bahawa ini adalah pil tidur. Maria memberikan raja ini "ubat", tetapi racun itu meminum kerbau. Namun, tidak ada yang dapat menghentikan intrik pembunuhan - Botwell meletupkan rumah Raja Henry. Di kejauhan, tangisan orang ramai semakin banyak didengar. Botvel dengan ratu bersembunyi.
